Nutriţia microorganismelor

Nutriţia microorganismelor este un proces fiziologic complex prin care microorganismele îşi procură elementele necesare şi energia pentru biosinteza compuşilor celulari, pentru creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor vitale.

Procesul de nutriţie se desfăşoară în cadrul metabolismului celular prin reacţii de degradare a compuşilor macromoleculari în compuşi cu masă moleculară redusă ce pot fi transportaţi în interiorul celulei, reacţii exergonice ce au loc în cadrul catabolismului celular. Concomitent cu reacţiile de catabolism, folosind compuşi simpli şi energie, celula vie sintetizează compuşi celulari esenţiali pentru creştere, în cadrul anabolismului. Viaţa celulei microbiene este posibilă atât timp cât cele două procese se desfăşoară concomitent.

Celula bacteriană poate utiliza între 300-600 tipuri de molecule diferite din care aproximativ 50% sunt reprezentate de molecula de apă şi ioni. Se apreciază că fără a lua în calcul moleculele de apă celula de drojdie poate utiliza până la 500 molecule mici şi peste 4000 de macromolecule.

Microorganismele întâlnite în industria alimentară sunt microorganisme chimiosintetizante şi îşi obţin energia prin degradarea compuşilor organici cu eliberarea energiei potenţiale a substratului nutritiv pe care aceasta se dezvoltă dând de cele mai multe ori alterarea specifică a acestuia. Prin substrat nutritiv se înţelege acel mediu care conţine apă, surse de energie (de natură glucidică), surse asimilabile de azot, săruri minerale şi facultativ factori de creştere.

Tipuri nutriţionale şi surse nutritive

Microorganismele care pot folosi CO₂ ca sursă unică sau principală de carbon sun numite autotrofe spre deosebire de cele heterotrofe care folosesc ca sursă de carbon moleculele organice preformate de la alte organisme. Ca rezultat al adaptării microorganismelor la diferite condiţii de mediu ambiant , în funcţie de sursele accesibile, acestea pot aparţine la 4 tipuri nutriţionale:

• chemoorganotrofe heterotrofe îşi obţin energia pe cale chimică, prin procese de oxidare a compuşilor organici şi procură oxigenul şi hidrogenul din compuşi organici şi anorganici (fungi şi bacterii);
• fotolitotrofe autrotrofe (alge, bacterii din ape) folosesc energia luminoase în procese de biosinteză şi folosesc sursa de carbon, hidrogen şi oxigen din compuşi anorganici;
• fotolitotrofe heterotrofe folosesc energia luminoasă iar ca sursă majoră de carbon, CO₂ din aer (bacterii sulfuroase);
• chimiolitotrofe autotrofe (sulfobacterii, ferobacterii) îşi obţin energia pe cale chimică, iar ca sursă de carbon şi hidrogen servesc compuşii anorganici.

Microorganismele cu rol în industria alimentară (drojdii, mucegaiuri, şi bacterii aparţin primului tip nutriţional. Fiind adaptate să se dezvolte prin asimilarea carbonului din materie organică sunt cunoscute ca agenţi selecţionaţi pentru dirijarea proceselor fermentative industriale, ca agenţi de alterare sau patogeni . În primul tip nutriţional al microorganismelor organotrofe se disting următoarele subgrupe:

• microorganisme saproorganotrofe (saprofite) se dezvoltă folosind ca sursă de carbon şi energie, materia organică nevie. În această categorie intră majoritatea microorganismelor cu aplicaţii industriale, dar şi bacteriile de putrefacţie, microorganismele care se dezvoltă pe alimente;
• microorganisme comensale se dezvoltă la suprafaţa sau interiorul organismelor vii (plante sau animale) beneficiind de această asociere şi hrănindu-se cu substanţe ce rezultă în mod natural din activitatea metabolică a acestora. Se pot exemplifica microorganisme din microbiota epifită a plantelor, a pielii, din microbiota intestinală;
• microorganismele patogene sau parazite pot fi strict patogene fiind specializate să se hrănească şi să trăiască parazitând celula vie;
• microorganismele potenţial patogene pot să crească pe produse alimentare bogate în nutrienţi şi pot în anumite condiţii să elaboreze toxine, însă prin îngerarea alimentului contaminat se produc stări de toxiinfecţii alimentare sau toxicoze.

Surse de nutriţie preferate de microorganismele organotrofe

Surse de carbon

Nu există nici o sursă de carbon care să nu fie utilizată pe cale microbiană. Există microorganisme care pot utiliza foarte mult sursa de carbon, exemplu Pseudomonas cepacia care pot utiliza peste 100 surse diferite de carbon, alte bacterii, de exemplu din genul Letospira folosesc ca sursă principală de C şi energie numai acizii graşi cu număr mare de C în moleculă.

Dintre sursele de C naturale întâlnite în materii prime alimentare sau utilizate în compoziţia mediilor de cultură sunt preferate următoarele:

• poliglucide : amidon, celuloză, substanţe pectice, care pot fi folosite în special de către bacterii şi microorganisme producătoare de enzime specifice extracelulare;
• monoglucide (hexoze, pentoze), diglucide , reprezintă atât sursa de carbon cât şi de energie pentru toate microorganismele şi sursa de bază în nutriţia drojdiilor;
• acizi organici (acid lactic, malic, acetic) pot fi o sursă de C pentru microorganisme şi unele drojdii;
• alcoolii sunt utilizaţi de către drojdii oxidative (g. Candida, g. Pichia) şi de bacterii (g. Acetobacter).

Deoarece carbonul reprezintă max. 50% din substanţa uscată a celulei la alcătuirea mediilor de cultură se calculează cantitatea de nutrient ce trebuie adăugată (în funcţie de masa moleculară şi de conţinutul în carbon) pentru obţinerea unei cantităţi corespunzătoare de biomasă.

Nutrienţi cu N,P,S

Pentru creştere, microorganismele necesită cantităţi mari de azot, fosfor şi sulf, iar organotrofele le pot procura fie din sursele organice cu carbon, fie din compuşii anorganici. Se ştie că azotul (10-14% din substanţa uscată a celulei) este necesar pentru sinteza de aminoacizi, purine, puridine, unele lipide, coenzime. Multe microorganisme pot folosi azotul din aminoacizi şi amoniac prin încorporarea directă, cu ajutorul unor enzime. Unele bacterii pot reduce şi asimila azotul atmosferic folosind un sistem de nitrogenaze şi au un rol vital în asigurarea circuitului natural al azotului.

Proteinele pot fi folosite în nutriţie numai de către microorganismele ce produc proteaze extracelulare, respectiv bacterii - agenţi cu putrefacţie şi mucegaiuri - agenţi de putrezire. Se mai pot folosi în mediile de cultură a drojdiilor - sulfatul de amoniu şi ureea. Alţi compuşi cum ar fi nitraţii sunt asimilaţi de către mucegaiuri şi bacterii, nitriţii numai de către bacterii (g. Nitrosomonas) şi cu efect toxic pentru drojdii (înmulţirea este oprită la concentraţii de 200 mg nitraţi /dm³).

Nutriţia minerală

Pentru procurarea elementelor minore, sunt preferate de către microorganisme sărurile acestora în următoarea succesiune: fosfaţi, sulfaţi, azotaţi, carbonaţi. Efectul pe care îl are adăugarea diferitelor substanţe minerale asupra creşterii poate fi diferit prin indicele de utilitate specific, ce reprezintă raportul dintre biomasa formată pe un mediu de cultură complet şi cea rezultată în mediul carenţat în substanţa /elementul respectiv.

Factorii de creştere

Factorii de creştere sunt substanţele organice ce sunt esenţiale pentru creşterea microbiană şi nu pot fi sintetizate de microorganismul respectiv. Conform exigenţelor nutritive ale microorganismelor‚ încadrate în primul tip de nutriţie se poate stabili o anumită succesiune; cele mai pretenţioase din punct de vedere nutritiv sunt bacteriile gram pozitive‚ urmate de bacterii Gram-negative‚ şi respectiv drojdii şi mucegaiuri.

Factorii de creştere ca structură si funcţie metabolică intră in următoarele 3 categorii:

• aminoacizii sunt necesari pentru sinteza de proteine / enzime;
• purine si pirimidine , pentru sinteza acizilor nucleici;
• vitamine, care functionează ca grupari prostetice ale unor enzime sau cu funcţie de coenzime.

În funcţie de natura microorganismelor necesarul de aminoacizi variază între 0 si 18 aminoacizi.

Dintre microorganismele din industria alimentară‚ drojdiile din genul Saccharomyces necesită biotină si acid paraaminobenzoic‚ bacteriile lactice ale genului genului Lactobacillus necesita acid folic, acid nicotinic, biotină, vitamina B, piridoxina, bacteriile acetice necesită acid p-aminobenzoic, iar Enteracoccus faecales are nevoie de 8 vitamine diferite pentru creştere.

Există şi un grup restrâns de substanţe denumite factori stimulatori de creştere care fără să fie indispensabile, prezenţa lor accelerează ritmul de creştere celulară.

Cunoaşterea condiţiilor de cultură şi a exigenţelor de nutriţie a fiecărui microorganism are o importanţă deosebită atât în practica de laborator cât şi la cultivarea industrială, deoarece permite reglarea activităţii fiziologice fie în direcţia obţinerii de biomasă, fie a unor produse de metabolism cu importanţă economică.

Modalităţi de transport a nutrienţilor în celula microbiană

Pentru realizarea procesului de nutriţie este obligatoriu ca nutrienţii să pătrundă în interiorul celulei pentru a fi metabolizaţi. Nutrienţii solubili cu molecule mici pot pătrunde în celula microbiană pe diferite căi. Una din căile cele mai frecvente este pătrunderea prin difuzie şi anume prin:

• difuzie pasivă este difuzia ce se realizează ca urmare a unui gradient de concentraţie‚ posibil când în exteriorul celulei concentraţia nutrientului este superioară celui din interiorul celulei. Prin anumiţi pori ai membranei plasmatice nutrientul pătrunde în interior si este metabolizat.
• difuzie facilitată se realizează ca urmare a prezenţei în biomembrane a unor proteine receptoare denumite permeaze, localizate la nivelul plasmalemei sau în spaţiul periplasmic. Permeaza recunoaşte şi leagă molecula solubilă a apei schimbându-şi conformaţia şi o eliberează in interiorul celulei. Apoi aceasta îşi reia poziţia orientată spre exteriorul membranei plasmatice si este pregătită pentru a prelua o nouă moleculă. Acest proces poate avea loc atâta timp cât concentraţia moleculelor nutrient este mai mare în exteriorul celulei faţă de cea internă.

Difuzia facilitată este mai importantă la celulele de tip eucariot pentru transportul aminoacizilor si al glucidelor, în timp ce la procariote serveşte pentru transportul glicerolului.

Microorganismele adesea se întâlnesc in habitate în care conţinutul în nutrienţi este foarte redus încât pentru creştere este important transportul şi concentrarea lor in celulă. În aceasta situaţie, transportul se face contra gradientului normal de concentraţie, cu consum de energie, prin transport activ şi translocaţie de grup.

Transportul activ – transportul în celulă este asigurat chiar în absenţa gradientului de concentraţie şi se realizează cu consum de energie. Transportul se activează ca urmare a energiei eliberate prin transformare ATP în ADP.

Translocaţia de grup – este un transport activ întâlnit la drojdii şi mucegaiuri în care intervine un sistem enzimatic complex de transferaze, care permit pătrunderea glucidelor prin membrane sub forma esterilor fosforici. Celulele pot face schimb cu mediul exterior nu numai cu ioni şi glucide ci şi cu glucide compuşi macromoleculari.

Astfel, bacteriile de exemplu pot secreta proteine printr-un proces de exocitoză. Este posibilă si pătrunderea unor astfel de macromolecule in interiorul celulei prin procese de endocitoză.

Medii de cultură

Un mediu de cultură reprezintă un substrat nutritiv complex, cu rol de aliment, care trebuie să asigure microorganismului ce urmează a fi cultivat, cantitatea necesara de apă, surse de carbon, azot, substanţe minerale, factori de creştere, substanţe care să îi furnizeze cantitatea de energie cât şi toate elementele folosite de celulă în procese de creştere, reproducere şi întreţinerea funcţiilor vitale.

Mediul de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

• să corespundă din punct de vedere nutritiv;
• să aibă o concentraţie a substanţei dizolvate în mediu care să nu influenţeze negativ schimburile osmotice ale celulei;
• să nu conţină substanţe toxice sau să genereze compuşi toxici în urma creşterii culturii microbiene;
• să aibă un anumit pH sau rH;
• să fie steril astfel încât să nu dezvolte numai celule introduse prin inocul.

În practica de laborator mediile de cultură se folosesc pentru izolarea din medii naturale a diferitelor microorganisme pentru obţinerea de culturi pure, pentru cultivarea acestora în scopul obţinerii de biomasă sau pentru întreţinerea culturilor pure selecţionate. În scop industrial mediile de cultură se folosesc pentru obţinerea de celule sau a compuşilor rezultaţi prin activitatea microorganismelor selecţionate. În funcţie de destinaţia lor, mediile de cultură se diferenţiază astfel:

Medii de cultură generale care asigură dezvoltarea unui număr mare de specii şi genuri deoarece includ în compoziţia lor substanţe nutritive diversificate.

Dintre mediile de cultură generale folosite în practica laboratorului de microbiologie menţionăm:

• bulionul de carne lichid sau gelozat (BCA);
• mediul triptonă - extract de drojdii - glucoză – agar;
• mustul de malţ – agar (MMA) pentru cultivarea drojdiilor şi mucegaiurilor;

Medii de cultură selective sunt medii cu o compoziţie chimică definită care permit dezvoltarea unui grup restrâns de microorganisme sau chiar a unei specii. Aceste medii conţin pe lângă substanţe nutritive şi substanţe cu efect inhibitor asupra altor microorganisme însoţitoare întâlnite în microbiota din care se face izolarea culturii ce dorim să o selecţionăm.

Un mediu selectiv folosit la determinarea bacteriilor coliforme este BLBV (bulion – bilă – lactoză – verde briliant) în care sărurile biliare inhibă alte bacterii, în timp ce coliformii sunt adaptaţi. Numărul mediilor selective este foarte mare şi permit izolarea unor specii de interes industrial sau se folosesc pentru identificarea, determinarea microorganismelor contaminante în produse alimentare.

Medii de cultură de diferenţiere – aceste medii permit separarea speciilor în funcţie de anumite caractere biochimice, atunci când acestea au fost selectate dintr-o microbiotă eterogenă.

Medii de îmbogăţire (fortifiate) sunt destinate separării şi cultivării unor microorganisme pretenţioase din punct de vedere nutritiv şi care se află în număr redus în produsul analizat din punct de vedre microbiologic.

În funcţie de compoziţie şi provenienţă, mediile de cultură pot fi medii naturale şi medii sintetice.

Mediile naturale sunt cele mai utilizate deoarece reproduc condiţiile în care se dezvoltă microorganismele. Mediile naturale de origine vegetală sunt sucuri de fructe, de legume, mustul de malţ, legume fierte/ terciute, fructe, infuzii de plante.

Ca medii de origine animală se folosesc după sterilizare, laptele, sânge (pentru bacterii facultativ patogene), zerul, carnea, bulionul de carne, ficat, ouă.

În condiţii de laborator se folosesc atât medii lichide, în special pentru cultivarea microorganismelor facultativ anaerobe, pentru studiul proceselor fermentative, medii solide – pâine, cartofi felii, ş.a. şi frecvent medii solidificate obţinute prin adăugarea în mediile lichide a unor agenţi de solidificare.

Pentru solidificarea mediilor de cultură se foloseşte:

• agar – agarul (geloza) un diglucid obţinut din alge ale genului Gelidium având în structură molecule de galactoză şi acid D – galacturonic legate prin legături 1,2,1,3 glicozidice. În stare purificată se prezintă sub formă de pulbere sau fibre si se adaugă in cantitate de 0,5 – 2 % mediu lichid.
• gelatina agent de solidificare de natura proteică, extrasă din ţesuturi organice. Se foloseşte in cantitate de 12 – 15 g% .

În afara mediilor descrise şi care se pot prepara in condiţii de laborator, numeroase firme sunt specializate în fabricarea de medii de cultură ce pot fi livrate sub diverse forme. Astfel sunt medii gata preparate sau sub formă de pulberi ce pot fi reconstituite conform reţetei şi au un termen mare de valabilitate.

Medii fermentative sunt medii de cultură industriale destinate producerii unor cantităţi mari de celule sau pentru obţinerea de produşi de metabolism cu valoare economică.

Diversitatea mediilor de cultură este datorată si capacitaţii de adaptare a numeroase microorganisme întâlnite în habitaturile naturale cât şi de faptul că prin modificarea compoziţiei mediilor de cultură se pot obţine randamente superioare în produşi de metabolism microbian cu valoare economică.

Mediile de cultură sunt utilizate frecvent în tehnici microbiologice de laborator, pentru izolarea, cultivarea şi întreţinerea culturilor pure şi pentru controlul microbiologic al produselor alimentare.