Multicelularitatea organismului şi diferenţierea celulară

Celulele eucariote ating un grad superior de evoluţie în momentul în care, prin procesul de diferenţiere, apar tipuri celulare diferite ca formă, structură şi funcţie, asociate în organisme multicelulare.

Această multicelularitate este condiţionată de:

• diferenţierea sau specializarea celulelor care le-a permis îndeplinirea unor funcţii specifice;
• dezvoltarea unor sisteme de integrare care să asigure cooperarea funcţională intercelulară;
• dezvoltarea unor structuri şi modalităţi care să asigure coeziunea intercelulară.

Multicelularitatea organismului

Prima formă de multicelularitate a fost asocierea organismelor unicelulare, animale sau vegetale, în colonii.

Formarea coloniilor presupune că celulele rezultate printr-o formă de diviziune nu devin libere, ci rămân grupate în agregate celulare mai mari sau mai mici. În cadrul coloniei se diferenţiază categorii de celule specializate pentru anumite funcţii (nutriţie, reproducere, apărare, locomoţie).

Celulele coloniei comunică şi cooperează prin receptori de membrană şi transport intercelular de substanţe şi se menţin aderente prin punţi citoplasmatice (la celulele vegetale) sau prin diferite molecule organice din matricea intercelulară (la celulele animale).

Dacă la speciile inferioare, cum sunt spongierii, organismul este format dintr-un simplu perete epitelial în care se disting doar câteva tipuri de celule specializate, la celenterate corpul lor prezintă un epiteliu extern (ectoderm) şi unul intern (endoderm), având numeroase tipuri de celule diferenţiate cu funcţie digestivă, glandulară, senzorială, nervoasă şi contractilă, toate cuprinse într-o matrice intercelulară amorfă.

Pe parcursul evoluţiei speciilor, multicelularitatea a crescut atât în privinţa numărului de celule diferenţiate cât şi a complexităţii lor structurale şi funcţionale. Astfel, la om şi la vertebratele superioare se diferenţiază în cursul ontogeniei peste 200 de tipuri de celule.

Dintre acestea, unele se află asociate în ţesuturi (epitelial, conjunctiv, muscular, nervos, hematogen) care, asociate în proporţii variabile, alcătuiesc toate organele marilor aparate şi sisteme anatomice (circulator, respirator, digestiv, uro-genital, endocrin şi nervos).

La organismele superioare cu reproducere sexuată deosebim două tipuri diferite de celule:

• celulele germinative, localizate în gonade (testicule şi ovare), reprezentate de celulele sexuale mature sau gameţi (ovocite la femele şi spermatozoizi la masculi), precum şi de celulele lor precursoare sau imature. Aceste tipuri celulare sunt celule haploide (cu n cromozomi) prin care se asigură generaţiile de descendenţi;
• celulele somatice, adică, exceptând celulele germinative, toate celelalte tipuri celulare din organism, prezente în structura ţesuturilor şi organelor. Celulele somatice, cu excepţia celor binucleate sau multinucleate, sunt celule diploide (cu 2n cromozomi).

În oricare din organele corpului sunt prezente două categorii de celule somatice, diferite prin funcţiile lor.

• unele dintre aceste celule, numeric majoritare, constituie parenchimul, o componentă formată din celule ce asigură funcţia specifică a organelor;
• a doua categorie cuprinde celulele de natură conjunctivo-vasculo- nervoasă ce constituie stroma organelor, componenta cu rol de legătură, de susţinere şi trofic.

Cu toată această multitudine de celule de diferite tipuri, un organism superior este un sistem structural şi funcţional coerent datorită în principal existenţei a două sisteme de integrare:

• sistemul nervos
• sistemul endocrin

În ultimul timp, s-a evidenţiat rolul reglator al unui sistem paracrin, format din celule izolate, dispersate în masa multor organe, secreţia lor difuzând local sau acţionând asupra celulelor din vecinătate.

Cât priveşte coeziunea intercelulară, aceasta este asigurată pe lângă unele forţe fizice şi de numeroase molecule din matricea intercelulară şi de către o serie de dispozitive sub-microscopice de la nivelul membranelor celulare, numite joncţiuni intercelulare.

Multicelularitatea, evaluată la om, înseamnă 10 celule (mii de miliarde) la nou-născut şi 10¹⁵ celule (milioane de miliarde) la adult. Biologia acestor celule este relativ simplă: ele provin dintr-o celulă preexistentă care, în cazul celulelor somatice, printr-o diviziune mitotică (ecuaţională), va furniza două celule-fiice diploide şi ele. Acestea, este posibil să se mai dividă sau doar or creşte, se vor diferenţia, vor îmbătrâni pentru ca în final, după o existenţă foarte diferită ca durată, să intre în agonie şi apoi să dispară prin una din formele morţii celulare.

Dimpotrivă, în cazul celulelor germinative, pe parcursul spermatogenezei şi ovogenezei, intervine o diviziune celulară meiotică (reducţională) prin care gameţii maturi ajung celule haploide.

Se estimează că în celulele somatice din corpul unui om matur se petrec circa 350 de miliarde de mitoze în 24 de ore (circa 4 milioane pe secundă), celulele-fiice rezultate înlocuind un număr aproximativ egal de celule moarte.

Această proliferare (multiplicare, înmulţire) celulară asigură la indivizii nou-născuţi şi la tineret nu numai înlocuirea celulelor moarte (homeostazia celulară sau turnover-ul celular) ci şi creşterea corporală, deoarece numărul celulelor nou-formate este superior numărului de celule moarte.

Nu putem separa complet multicelularitatea organismului de diferenţierea celulară, deoarece aceste două procese decurg adesea în strânsă corelaţie.

Aşa cum s-a descris în capitolul „Funcţiile generale ale celulelor”, celulele-fiice rezultate printr-o diviziune mitotică nu sunt întotdeauna identice cu celula-mamă.

Numai în diviziunea numită mitoză homoplastică, simetrică sau egală, întâlnită doar la celulele nediferenţiate sau puţin diferenţiate, celulele-fiice sunt asemănătoare şi între ele şi cu celula-mamă, adică rămân tot nediferenţiate.

Diferenţierea celulară se petrece doar în celelalte tipuri de mitoze. Astfel, prin mitoza heteroplastică sau inegală rezultă două celule-fiice identice între ele, dar diferite, mai diferenţiate faţă de celula-mamă. Din această cauză, acest tip de multiplicare se mai numeşte mitoză de diferenţiere.

În urma mitozei homo-heteroplastice, numită şi asimetrică sau nodală, una dintre celulele-fiice va rămâne nediferenţiată, asemănătoare cu celula- mamă, pe când cealaltă celulă-fiică va fi diferită, adică diferenţiată. Un exemplu de astfel de mitoză este cea a spermatogoniilor, celule care asigură producerea continuă de spermatozoizi, sau cea a celulelor de înlocuire, numite şi cambiale, aflate în stratul bazal al epiteliilor stratificate.

Acest tip de multiplicare celulară asigură, pe de o parte formarea de celule diferenţiate, iar pe de altă parte, asigură păstrarea stocului de celule cu rol regenerator.

Un tip cu totul aparte de mitoză este mitoza de dediferentiere sau de întinerire, întâlnită în procesul de formare a celulelor sângelui (hematopoieza). În acest caz, celulele-fiice sunt mai tinere, adică mai puţin diferenţiate comparativ cu celula-mamă.

Celulele somatice dintr-un organism multicelular pot fi clasificate, în raport cu dinamica ciclurilor lor celulare în trei categorii:

• celulele statice sunt celule cu o înaltă specializare, ca neuronii şi fibrele musculare miocardice şi scheletale, care îşi pierd definitiv capacitatea de diviziune. Putem considera că ele părăsesc ciclul celular şi rămân blocate în faza G₁ a acestuia.
• celulele în tranzit, provenite din celule preexistente numite celule precursoare, au o durată de viaţă bine determinată pentru fiecare tip celular, dar în general scurtă (zile sau luni). În unele organe, aceste celule cât sunt încă tinere mai pot parcurge un ciclu celular. Gradul lor de maturizare se poate distinge la microscop după anumite particularităţi morfologice şi de colorabilitate. Exemple tipice de celule în tranzit sunt keratinocitele din epiderm sau enterocitele din epiteliul intestinal.
• celulele stem, numite în trecut celule-matcă sau celule suşe, formează o populaţie de celule puţin diferenţiate, celulele nediferenţiate fiind numai celula-ou şi celulele ce rezultă prin segmentarea acestuia, adică primele blastomere, numite şi celule stem embrionare.

Celulele stem ale adultului sunt apte de a-şi menţine capacitatea de auto- reînnoire pe toată durata vieţii indivizilor, adică neangajate în ciclul celular şi blocate în faza G₀ a acestuia. Unele celule stem, în anumite condiţii şi sub acţiunea inductoare a unor mesageri specifici, se pot angaja în procesul de diferenţiere, întotdeauna numai prin diviziuni homo-heteroplastice sau nodale.

Dintre celulele-fiice una va persista ca celulă stem contribuind la menţinerea rezervei de celule stem, iar cealaltă celulă-fiică va deveni un tip celular specific, adică diferenţiată ireversibil.

Unele celule stem, în funcţie de potenţialul lor de diferenţiere, sunt considerate celule stem unipotente, adică generatoare de celule-fiice a căror diferenţiere este asigurată într-o unică direcţie. Este cazul celulelor stem din stratul bazal sau generator al epidermului, care pot fi numai sursă de keratinocite.

Figura 88 - Multiplicarea şi diferenţierea celulelor stem din epiderm

În schimb, printre celulele din măduva osoasă hematogenă se găsesc celule stem multipotente, care pot da naştere la cel puţin două tipuri de celule diferenţiate.

Figura 89 - Multiplicarea şi diferenţierea celulelor stem din măduva osoasă hematogenă

Celulele stem se află în diferite ţesuturi şi organe asociate cu celulele în tranzit, însă constituie o populaţie celulară redusă numeric: 1-2% în epiteliul tubilor seminiferi din testicul; 0,4% în măduva osoasă hematogenă; 10% în stratul bazal al epidermului; doar câteva în epiteliul de la gâtul glandelor intestinale Lieberkuhn.

Aceste celule stem nu pot fi evidenţiate prin metodele histologice de rutină, dar prin metode speciale au putut fi identificate următoarele deosebiri fată de celulele învecinate lor:

• reacţionează diferit la radiaţii;
• prezintă un ciclu celular mai lung;
• încorporează mai rapid markeri radioactivi ai ARN (timidina tritiată).

Menţinerea celularităţii (homeostazia celulară)

În ţesuturile sau organele indivizilor adulţi (exceptând ţesuturile şi organele cu celule statice - neuroni şi fibre musculare striate) apar două situaţii:

Prima situaţie, când prin prezenţa unui număr redus de celule stem angajate în procesul de diferenţiere se vor furniza celule mici, specializate, integrate funcţional în ţesutul sau organul în care se află. Ele vor înlocui celulele moarte ale populaţiei majoritare de celule stabile, care în mod normal prezintă doar o activitate mitotică redusă, dar suficientă pentru a menţine constant procentul de celule diferenţiate.

A doua situaţie este cea a ţesuturilor în care celulele ating un nivel de diferenţiere terminală, durata vieţii lor este scurtă şi nu îşi pot relua ciclul celular. Astfel de ţesuturi necesită prezenţa de celule pentru reînnoire rapidă, capabile de o activitate mitotică intensă.

Exemplu tipic pentru acest tip de reînnoire celulară este măduva osoasă hematogenă, la care punctul de plecare este o celulă stem multipotentă. Aceasta, prin proliferare, va furniza două linii celulare de celule stem tot multipotente, o linie pentru celulele limfoide (limfocitele) şi altă linie pentru celulele mieloide (eritrocite, leucocite granulare, monocite şi megakariocite).

Acestea vor genera celule-fiice cu posibilităţi de evoluţie mai limitate, numite celule progenitoare . Prin mitoze asimetrice, acestea vor genera celule progenitoare şi celule mai diferenţiate, numite celule precursoare sau blaste, ce vor putea evolua doar spre un singur fel de celulă sanguină. Asigurarea unui număr mare de celule sanguine se face prin diviziuni frecvente şi repetate ale celulelor progenitoare şi precursoare.

Factorii de control ai multicelularităţii

Multicelularitatea se realizează, aşa cum s-a descris prin modalităţi diferite de proliferare celulară, aceasta asigurând atât creşterea organismului, cât şi menţinerea constantă a densităţii celulare (homeostazia celulară). Ca orice proces fiziologic din organism şi proliferarea celulară are mecanisme complexe de reglare şi control. Este vorba, în principal, de factori intracelulari şi de factori extracelulari, endocrini şi, mai ales, paracrini.

De menţionat sunt, în primul rând, factorii care reglează ciclul celular:

• factorul activator al fazei S (SAF = S phase activating factor) care intervine iniţiind replicarea ADN;
• factorul de întârziere a mitozei (MDS = mitose delaying signal);
• factorul de activare a mitozei (MPF = mitose promoting factor);
• proteinkinazele şi ciclinele sunt factori ce reglează trecerea din faza G₁ în faza S şi din faza G₂ în faza M a ciclului celular.

Un rol important, nu numai în multiplicarea şi homeostazia celulară dar şi în procesele de regenerare reparatorie, îl au cei peste 30 de factori de creştere mitogeni, notaţi cu GF (Growth Factors). Mai cunoscuţi sunt factorul de creştere epidermic (EGF), factorul de creştere al fibroblastelor (FGF), factorul de creştere al celulelor endoteliale (ECGF), iar în hematopoieză intervine eritropoietina (EPO) pentru seria eritrocitară şi interleukina-3 (IL-3) pentru seria leucocitară.

Aceşti factori de creştere, după ce se cuplează cu receptorii specifici din membrana celulelor-ţintă, sunt endocitaţi, ajung în nucleu unde interacţionează cu proteinele ce activează genele reglatoare ale replicării ADN-ului. În acest fel, ei pot să determine scoaterea celulei din faza de repaus (GO) şi intrarea ei în faza S (sinteza şi replicarea ADN).

Factorii de creştere intervin în proliferarea celulară şi prin faptul că stimulând proteo-sinteza modifică raportul nucleo-citoplasmatic în favoarea intrării celulei în ciclul celular. Factorii de creştere intervin şi în menţinerea constantă a densităţii populaţiei celulare dintr-un anumit organ.

La o anumită densitate a celulelor respective, receptorii pentru factorii de creştere din membrană fiind foarte numeroşi se produce o competiţie pentru factorul de creştere din mediul extracelular, scăderea concentraţiei sale ducând la blocarea proliferării celulare peste un anumit prag.

Proliferarea celulară este dependentă şi de existenta adeziunilor de tip celulă-celulă şi celulă-matrice extracelulară . Majoritatea celulelor animale, în decursul ciclului celular, îşi pierd parţial aderenţele şi se rotunjesc, începând cu faza S până la sfârşitul mitozei.

Aderenţa la suportul fibrilar din matricea extracelulară se face prin structuri numite contacte focale sau plăci de adeziune. În aceste puncte de ataşare filamentele de actină din citoschelet se ataşează de capătul intracelular al unei glicoproteine trans-membranare, numită receptor pentru fibronectină, deoarece extremitatea sa extracelulară aderă la fibrilele de fibronectină din matricea extracelulară.

Desfacerea acestei aderenţe este posibilă sub acţiunea unei tirozinkinaze, numită proteina SRC. La desfacerea acestor aderenţe mai participă şi enzima numită activator de plasminogen, care activează plasmina, o enzimă proteolitică pentru fibronectină. Aceste două mecanisme de desfacere ale aderenţelor celulare sunt declanşate de prezenţa factorilor de creştere. Desfacerea aderenţelor celulare va permite situarea în ţesut a celulelor-fiice şi rearanjarea contactelor focale.

Cunoştinţele referitoare la multicelularitate şi proliferarea celulară ne permit să concluzionăm că celulele din parenchimul oricărui organ (exceptând organele sistemului nervos şi muscular) nu sunt o populaţie omogenă, ci o populaţie ce poate fi împărţită în trei categorii sau compartimente celulare:

• compartimentul proliferativ reprezentat de celulele în tranzit;
• compartimentul neproliferativ reprezentat de celulele stem, celule care doar sub influenţa unor factori mitogeni pot trece în compartimentul proliferativ;
• compartimentul celulelor senescente (îmbătrânite, în agonie sau în moarte celulară).

Acest ultim compartiment, deşi nu foarte evident în preparatele microscopice, are în fiziologia organismului un rol la fel de important ca moartea celulară.

Cauzele, mecanismele şi manifestările morfologice ale îmbătrânirii celulare şi ale morţii celulare prin apoptoză sau necroză vor fi prezentate în capitolul îmbătrânirea şi moartea celulelor.

Regenerarea

În cazul organismelor superioare, regenerarea se referă la procesele de reparare sau vindecare, consecutive unor agresiuni traumatice, toxice, fizice sau infecţioase.

O capacitate deosebită de reparare prezintă ţesutul osos şi cel epitelial de acoperire. În organele parenchimatoase (ficat, rinichi, pulmoni etc.) repararea se face prin ţesut conjunctiv cicatriceal. Se pot regenera fibrele musculare netede, în anumite condiţii şi cele striate scheletale, dar nu şi fibrele musculare miocardice.

Un proces de regenerare se observă şi în cazul lezării unor fibre nervoase, dar repararea în cazul leziunilor din sistemul nervos central se face doar prin cicatrice formate din nevroglii (glioame).

Regenerarea morfologică şi funcţională a unor organe întregi, de exemplu membrele sau coada, este posibilă doar la unele vertebrate cum sunt amfibienii modele primitive (salamandra, tritonul, axolotul) şi la unii peşti teleosteeni (peştele zebră). La aceste specii, amputarea unui membru determină producerea unor factori incomplet cunoscuţi care, blocând genele diferenţierii celulare, inversează sensul evoluţiei celulelor mature.

Ele îşi vor pierde specificitatea de celule mature, reîntorcându-se la stadiul de celule slab diferenţiate sau imature, fenomenul numindu-se dediferentiere. În continuare, genele reglatoare ale ciclului celular vor fi supra-exprimate determinând astfel multiplicarea celulelor dediferenţiate, care au provenit din toate ţesuturile membrului amputat.

Ele vor forma un mugure tisular, numit blastem de regenerare. Mai departe, procesul decurge ca şi în cursul dezvoltării embrionare, adică vor fi activate genele care guvernează creşterea şi morfogeneza membrelor (HoxA), iar celulele blastemului de regenerare se vor multiplica şi diferenţia formând diversele ţesuturi, regenerând un membru identic celui amputat.

În cazul regenerării organelor interne, procesul decurge la fel, dar este guvernat de gene specifice. Omul şi mamiferele posedă mecanismele genetice necesare regenerării, aceasta fiind posibilă doar în stadiul embrionar şi numai pe anumite ţesuturi.

În stadiul post-natal, formarea blastemului de regenerare nu mai este posibilă, semn că această proprietate s-a pierdut de-a lungul evoluţiei. Repararea acestei proprietăţi ne impune identificarea factorilor care la speciile urodele şi teleosteeni intervin în regenerare. Până în prezent se ştie că unul dintre aceşti factori este trombina, factor al coagulării, care declanşează reintrarea celulelor blastemului în ciclul celular. Alt factor cunoscut este metalo-proteaza care degradând proteinele matricei extracelulare permite detaşarea celulelor. Însă, aceşti factori sunt prezenţi şi la mamifere.

Cercetările actuale sunt orientate spre identificarea genelor, care exprimă sinteza acelor factori ai regenerării care lipsesc la speciile de mamifere. Pentru aceasta, se recurge la secvenţierea ARNm implicat în sinteza lor, în ideea că identificare şi izolarea acestor factori vor putea fi folosite în terapeutică.

Diferenţierea celulară

Întreaga populaţie celulară din corpul speciilor multicelulare, numeric de ordinul milioanelor de miliarde de celule la om, provine dintr-o singură celulă, ovocitul fertilizat sau celula-ou.

Acest principiu a fost susţinut de anatomistul englez William Harwey încă din 1651, şi enunţat succint prin axioma ”Ex ovo omnia”, adică orice viaţă provine dintr-un ou. A fost un concept evoluţionist combătut de adepţii creaţionismului prin întrebarea „Dar cum a apărut primul om ? ”

În prezent, răspunsul este trecut în domeniul cercetărilor cu privire la originea celulei ancestrale, prezentată în capitolul „Noţiuni generale despre celule”.

Celula-ou ca potenţial evolutiv este o celulă totipotentă, adică aptă să asigure descendenţa a peste 200 de tipuri celulare diferite.

Multicelularitatea, aşa cum s-a descris anterior, se realizează prin proliferare (înmulţire, multiplicare) celulară, celulele nou-formate provenind din celule pre-existente. Acest adevăr a fost promovat de morfologul german Rudolf Virchow în 1858, prin formularea ”Omnis cellula e cellula” -prin care excludea posibilitatea formării de celule dintr-o materie organică neorganizată celular.

Toate celulele unui organism multicelular conţin în nucleul lor un genom complet, identic celui din celula-ou. Cu toate acestea, celulele se prezintă într-un număr mare de tipuri celulare, diferite ca formă, structură, compoziţie biochimică şi, mai ales, ca funcţie. Prin aceasta se poate afirma că deşi genotipic celulele sunt identice, ele diferă ca fenotip. Prin acelaşi genotip vom înţelege aceleaşi gene, admiţând că gena este o secvenţă de ADN cromozomial responsabilă de producerea unei anumite proteine, precum şi de sinteza unor molecule de ARN funcţional, ca ARNt, ARNm şi ARNr.

În genomul mamiferelor superioare, inclusiv în cel uman, se apreciază că există circa 30.000-40.000 de gene, în afară de cele numite gene reglatoare. Acestea pot iniţia sinteza unui număr între 30.000 şi 200.000 de proteine diferite, ceea ce înseamnă că ADN-ul nuclear codifică între 3 şi 11 milioane de polipeptide. Astfel, se asigură numărul relativ mare de tipuri de proteine necesare multiplelor funcţii celulare.

Aşa de exemplu, în neuronii din creierul şobolanului alb au fost identificate 170.000 de tipuri de molecule de ARNm implicate în transcrierea unui număr aproximativ egal de diferite polipeptide. Însă, pentru codificarea acestui număr enorm de polipeptide este activă doar o mică parte din ADN-ul genomic, marea masă a acestuia (circa 93%) neavând o funcţie genetică definită, adică ne-exprimată fenotipic.

Procesul de diferenţiere trebuie înţeles ca o specializare a unor grupuri de celule în procesul de „diviziune a muncii" în cadrul unui organism multicelular. Aceste grupe de celule se vor caracteriza prin aceea că, pe lângă proteinele pe care le posedă orice celulă, ele mai sintetizează un set de proteine specifice (keratina în celulele epidermului, hemoglobina în hematii, enzimele digestive în enterocite ş.a.). Astfel, fenotipul celular devine consecinţa directă a prezenţei proteinelor pe care celulele sunt apte să le elaboreze în vederea îndeplinirii funcţiilor generale şi, mai ales a unor funcţii specifice.

Diferenţierea celulară, cauza celor peste 200 de tipuri celulare, nu se realizează prin pierderea sau dobândirea de noi gene, ci prin modificări în expresia genică, sinteza de proteine fiind reglată calitativ şi cantitativ la nivelul transcripţiei ADN în ARNm şi apoi în translaţia ARMm în proteine.

Acest reglaj se realizează prin intervenţia unor proteine speciale, numite proteine reglatoare, care ataşându-se pe molecula de ADN la nivelul unor secvenţe ce controlează expresia anumitor gene structurale, vor activa sau supressa (bloca) transcripţia de ARNm de către ADN-ul genomic în funcţie de cerinţele tipului celular respectiv.

La fel ca proliferarea celulară şi diferenţierea este un proces inductibil.

Mesagerii inductori din mediul extracelular ajung în celule prin endocitare şi vor determina codificarea de proteine reglatoare.

În desfăşurarea diferenţierii, aspectele morfologice vizibile la microscop sunt precedate de modificări biochimice inaparente. Variabilităţi la nivelul ADN-ului genomic pot să survină prin mutaţii şi recombinări genetice sub acţiunea de durată a unor agenţi fizici, chimici sau biologici din mediul extern. Aşa de exemplu, unii agenţi chimici care produc metilarea ADN-ului, pot determina alterări radicale ale diferenţierii.

În general, diferenţierea celulară este ireversibilă, exceptând rare situaţii în care o celulă diferenţiată, matură poate genera prin mitoză celule tinere, puţin diferenţiate, proces numit dediferentiere.

Diferenţierea celulară trebuie considerată pe durata întregii dezvoltări ontogenice a unui organism animal, adică din momentul clivajului (segmentării) celulei-ou, urmat de formarea blastocystului, a embrionului tridermic, a ţesuturilor (histogeneza) şi a organelor (organogeneza).

Diferenţierea celulară continuă şi post-natal, în procesul de creştere, apoi în procesul de reînnoire (homeostazie) celulară şi în cel de regenerare.

În toate aceste etape, proliferarea şi diferenţierea celulară decurg aproape concomitent, în strânsă corelaţie cu factorii reglatori ai ciclului celular (descrişi în capitolul Multiplicarea celulelor).

Diferenţierea celulară în etapa embriogenezei

Iniţial reprezentat de o singură celulă, celula-ou, un organism multicelular devine, aşa cum s-a descris anterior, constituit din peste 200 de tipuri celulare, distincte ca formă şi funcţie. Acest fapt necesită, în afară de mecanismele ce controlează expresia genetică, adică diferenţierea, şi un program care asigură proliferarea, deplasarea şi situarea în spaţiu a celulelor în cursul embriogenezei.

Totul începe cu fecundarea (fertilizarea) ce poate fi considerată un caz de fuzionare a două celule specializate, fecundarea monospermică asigurând producerea unei celule-ou (zigot) diploide.

În faza imediat următoare, prin mitoze rapide şi repetate, numite diviziuni de segmentare (sau clivaj), se ajunge la o formaţiune embrionară globuloasă, plină, numită morulă, formată din 8-50 de celule sferice, numite blastomere.

Ulterior, prin formarea unei cavităţi centrale, se ajunge la stadiul de blastocyst, stadiu în care se petrece şi implantarea (nidaţia) în endometrul uterului matern.

Printr-un proces de proliferare, diferenţiere celulară şi remodelare, numit gastrulare, se ajunge în stadiul de embrion tridermic, format din trei foiţe celulare distincte: ectoderm, mezoderm şi endoderm.

Din celulele acestor trei foiţe embrionare, prin interacţiuni reciproce, se formează o primă schiţă a corpului embrionar, ca apoi toate organele acestuia să îşi aibă originea dintr-o singură foiţă (ca sistemul osos) sau din mai multe (ca ţesutul epitelial).

Sub aspectul diferenţierii celulare, celula-ou este cu certitudine o celulă nediferentiată, adică totipotentă.

La mamifere, blastomerele ce rezultă după primele diviziuni de segmentare îşi mai păstrează totipotenţa (la iepure până în morula cu 8-16 blasto-mere), dar ulterior survine pierderea totipotenţei în etape diferite în funcţie de specie.

La plante totipotenţa este mai persistentă, iar celulele provenite din orice organ al plantei şi cultivate in vitro vor creşte şi vor dezvolta o formaţiune numită callus. Acesta, dacă este disociat, iar celulele rezultate sunt tratate cu anumiţi hormoni vegetali şi apoi vor fi cultivate in vitro, se observă că fiecare celulă va genera o plantă întreagă.

Dimpotrivă, blastomerele formate în urma primelor diviziuni de segmentare, izolate şi cultivate in vitro nu vor mai putea evolua spre a forma un organism. Ele se pot multiplica la infinit, fără să prezinte semne de diferenţiere, adică rămân în stadiul embrionar.

S-a demonstrat experimental că totipotenţa blastomerelor este o proprietate a nucleului. Astfel, la broască nucleul prelevat dintr-un blastomer rezultat după primele diviziuni de segmentare şi transplantat într-o celulă-ou, al cărui nucleu a fost inactivat prin iradiere, a dus la dezvoltarea unui embrion normal.

Experimentul reuşeşte, dar numai în 1-2% din încercări, atunci când nucleul transplantat este prelevat dintr-o celulă diferenţiată, cum ar fi un enterocit (celulă absorbantă intestinală) sau keratinocit (celulă din epiderm).

Acest gen de experiment, numit clonare, a fost realizat pentru prima dată pe un mamifer de către cercetătorul englez Ian Wilmut, în 1997, când a utilizat nucleul unei celule secretoare din glanda mamară a unei oi.

De mare actualitate sunt în prezent celulele stem embrionare (ESC= Embryonic Stem Cells), ce au putut fi izolate şi cultivate de la un embrion uman, în urmă cu 15 ani. Cultivate in vitro, ele se pot multiplica la infinit, fără să se diferenţieze, adică rămân în stadiul embrionar. Este vorba de blastomere izolate din zigoţi la 5 zile după fecundare şi care, ca potenţial evolutiv sunt celule totipotente, adică sunt capabile sub acţiunea unor anumiţi factori inductori să genereze orice tip celular.

Însă, din motive etice, legea ce consideră zigoţii ca fiind persoane potenţial umane, interzice în multe ţări experimentarea şi utilizarea celulelor stem embrionare. Este însă permisă utilizarea celulelor stem embrionare prelevate din zigoţi supranumerari, obţinuţi prin fertilizare in vitro, dar neimplantaţi în uter matern, adică rămaşi fără proiect parental.

Există şi alte surse de celule stem, ca de exemplu celulele sanguine recoltate din cordonul ombilical la naştere, care pot fi păstrate prin congelare în azot lichid în "bănci de celule stem”. Scopul recoltării şi păstrării lor este terapeutic, în anumite anemii şi leucemii, în boli neurodegenerative, infarct miocardic, diabet ş.a. Problema imuno-compatibilităţii grefei este rezolvată prin clonare terapeutică, adică se transferă nucleul unei celule somatice aparţinând pacientului receptor într-un ovocit enucleat, iar din zigotul obţinut se izolează şi se cultivă celule stem embrionare pentru a obţine ţesutul compatibil cu organismul receptor.

Diferenţierea celulară în etapa organogenezei

La sfârşitul stadiului de gastrulare, când embrionul format din cele trei foiţe embrionare are, la om şi la mamifere, o formă de disc, planul corporal de bază este deja evident, cu extremităţile cefalică şi caudală.

În continuare, în etapa organogenezei, dezvoltarea se face conform acestui plan corporal, dar într-o perioadă de timp mai îndelungată. În această etapă a dezvoltării sunt de remarcat două fenomene:

• derularea histogenezei , adică dezvoltarea unor ţesuturi identificabile morfologic, prin procesul de diferenţiere celulară;
• creşterea corectă a structurilor corporale atât ca formă cât şi ca dimensiune, în conformitate cu un model prestabilit.

S-a arătat faptul că, în principal, diferenţierea celulară constă în sinteza unor proteine specifice fiecărui ţesut sau organ. Substratul molecular al acestui proces este bazat pe modele variabile de activare şi inactivare a genelor.

În această etapă, diferenţierea fiecărui nou tip celular necesită vecinătatea a cel puţin două tipuri celulare provenite din foiţe embrionare diferite. Interacţiunea dintre acestea se numeşte inducţie .

Pentru ca o populaţie celulară să fie indusă este necesar să aibă posibilitatea de a răspunde la semnalele celulelor inductoare, posibilitate numită competentă. Adesea, competenţa este o proprietate care se pierde cu timpul.

Posibilitatea unor celule de a răspunde la un inductor, necesită prezenţa pe membrana acestora a receptorilor trans-membranari de tip tirozin-kinaze. Aceşti receptori se pot cupla specific cu mesageri chimici, numiţi liganzi. Aceste molecule pot fi sintetizate şi eliberate în mediul extracelular de către celule aflate la distanţă sau ligandul este o moleculă trans-membranară, caz în care celulele inductoare trebuie să vină în contact cu cele induse.

Se descrie o inducţie instructivă, situaţie în care celulele inductoare, prin liganzii eliberaţi, determină exprimarea unor anumite gene în celulele induse, fapt ce va duce la diferenţierea acestora.

O altă modalitate este inducţia permisivă, caz în care celulele induse posedă toate cele necesare în vederea exprimării unui nou fenotip, dar au nevoie de un mediu extracelular favorabil exprimării capacităţii de diferenţiere.

Acest mecanism a fost demonstrat experimental în 1924 prin procedee de microchirurgie pe formaţiuni embrionare, de către embriologul german Hans Spemann [premiul Nobel 1935]. El a experimentat pe embrioni de amfibieni în stadiul de gastrulă transplantând o porţiune de ţesut ectodermal din zona anterioară a unui şanţ dorsal numit blastopor, în zona ventrală a embrionului. După o anumită perioadă de timp a constatat că în embrion, în afară de axul cordal dorsal, s-a format un al doilea ax, ventral. Regiunea din care s-a recoltat transplantul a fost numită organizator embrionar.

Fenomenul inducţiei mai poate fi demonstrat pe culturi celulare in vitro făcute cu două tipuri celulare (co-culturi). Dacă pe cultura iniţială cu un anumit tip celular se adaugă o populaţie celulară de alt tip, se poate verifica dacă a avut loc o inducţie după fenotipul celulelor.

In afară de semnalele care induc diferenţierea, determinând în celule sinteza unor proteine specifice, celulele mai recepţionează în cursul histogenezei şi organogenezei semnale de dezvoltare ce controlează proliferarea celulelor, deplasarea şi dispunerea lor în spaţiu, conform unui anumit plan corporal.

In acest mecanism reglator sunt implicategenele dezvoltării embrionare: genele materne, genele de segmentare şi genele homeotice.

Genele materne sunt elaborate, încă înainte de producerea fecundării, de către celulele din stratul granulos al foliculului ovarian şi apoi transferate în ovocitul activat. Rolul genelor materne este acela de a programa sinteza unor proteine, numite proteine morfogene, deoarece difuzând în matricea extracelulară ajung să determinepolarizarea zigotului (axul antero-posterior). Se atribuie genei bec (bicoid) morfogeneza polului embrionar anterior, iar genei td (tudor) şi genei osk (oskar) pe cea a polului posterior.

Genele de segmentare sunt gene proprii embrionare, ce guvernează împărţirea corpului în segmente anatomice. Acţiunea lor este mai evidentă la insecte, unde grupuri de gene (grupul gap, grupul parităţii şi grupul polarităţii) determină sinteza de proteine morfogene, care dirijează împărţirea corpului în segmente şi polarizarea antero-posterioară din fiecare segment. La vertebrate, o astfel de genă este gena sonic hedgehog, care dirijează dezvoltarea membrelor şi polarizarea dorso-ventrală a tubului neural şi a creierului.

Genele homeotice devin active la sfârşitul gastrulării, acţionând asupra ţesutului celor trei foiţe embrionare. Ele dirijează migrarea, amestecul şi poziţionarea diferitelor celule pe parcursul organogenezei şi sinteza unor molecule-semnal şi a moleculelor aderenţei intercelulare , toate cu rol important morfogenetic.

O particularitate a genelor homeotice este prezenţa în structura lor a unui segment de ADN numit homeobox, care le conferă capacitatea de a activa sau inhiba alte grupuri de gene. In toate aceste segmente de ADN este prezentă o secvenţă de 180 de nucleotide, mereu aceeaşi la majoritatea speciilor.

Informaţiile pe care celulele din diferite compartimente ale corpului le primesc în cursul morfogenezei se numesc informaţii de poziţie.

Datorită lor, tipuri similare de celule ajung să formeze organe diferite (membrele anterioare şi posterioare). Astfel, la embrionul de găină, mugurii (primordiile) din care urmează să se dezvolte membrele prezintă o structură identică: celule ectodermice la exterior şi mezodermice în interior. Dacă prin excizare chirurgicală se transplantează aceşti muguri în poziţie inversă, vom constata că anterior se va forma un picior, iar posterior o aripă.

Aceasta înseamnă că celulele aveau nu numai informaţia necesară pentru a se diferenţia formând celulele epidermice, osoase, cartilaginoase, musculare ş.a. ale unui membru, ci şi informaţia care să transmită forma organului.

Am văzut că această proprietate persistă şi la adult, dar numai la anumite specii cum sunt salamandra şi tritonul, la care regenerarea integrală a unor organe este posibilă.

În procesul de diferenţiere mai intervin şi genele proto-oncogene, care determină sinteza atât a celor peste 30 de factori de creştere celulară, cât şi a receptorilor pentru factorii de creştere din membrana celulelor.

Printre aceştia, un rol important îl joacă proteinele G (G =guanidintrifosfat), unele cu rol activator, iar altele cu rol inhibitor în procesul de transfer trans-membranar. Tot genele proto-oncogene codifică proteinele numite factori de transcripţie, care influenţează proliferarea şi diferenţierea celulară inhibând sau stimulând transcripţia în cursul sintezei proteinelor.

Genele care intervin reglator în cursul dezvoltării embrionare şi fetale îşi încetează activitatea, intrând într-o stare de represie, după ce au edificat diferitele ţesuturi şi organe. Ele rămân represate toată durata vieţii dacă nu survine, sub acţiunea unor agenţi mutageni, reintrarea lor în activitate. În acest caz, se vor produce dereglări ale proliferării celulare, cu caracter anarhic (tumoral).